摘要：目的运用网络药理学研究模式，基于小柴胡汤治疗肝炎过程中造成药物性肝损的临床不良反应伤（ADR）信息挖掘，探讨小柴胡汤治疗肝炎时产生肝损伤的“效-毒”作用靶点、通路和机制。方法以小柴胡汤为研究对象，借助整合药理学平台构建“效-毒”作用网络，预测分析其关键靶点和通路，应用Cytoscape软件对关键靶标所参与的通路整理分析，得到“效-毒”共同参与的通路及作用机制。结果小柴胡汤治疗肝炎时产生肝损伤的“效-毒”作用分析得出，在度值排名前的候选靶标中共同靶标有HADHA、HADH、NSDHL、ADH1A、ALDH3A2、GCK等40个，小柴胡汤中共同参与“效-毒”作用的化学成分包括柴胡27个、人参74个、半夏13个、生姜8个、甘草32个、大枣39个、黄芩33个，共个成分，共同作用于内分泌系统、神经系统、雌激素信号通路、趋化因子信号通路、内分泌和代谢疾病、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、神经退行性疾病7条通路参与“效-毒”过程。结论小柴胡汤治疗肝炎时产生肝损伤的“效-毒”作用可能与Ras/Raf/MEK/ERK、NF-κB、PI3K/AKT信号传导途径密切相关，通过调控细胞增殖、细胞凋亡、调控炎症因子的表达发挥作用。

经方小柴胡汤由柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣7味中药组成，首载于《伤寒论》，为和解少阳的代表方，具有和解表里之功效[1]。临床应用和实验研究均表明[2-3]，小柴胡汤可用于治疗病毒性肝炎、酒精性肝炎等肝炎疾病，能够有效改善肝脏功能。肝炎病因复杂，多因正气不足，邪气侵犯肝脏，肝失疏泄所致，湿热浊毒亦是其发生发展的主要因素之一；肝炎治则主要有清热解毒、扶正祛邪、化浊解郁等；小柴胡汤可解肝郁、疏肝气，气化则湿化，气行则瘀去[4]。方中柴胡、黄芩疏解少阳，人参、半夏扶正益气，生姜、大枣醒脾和胃，生甘草调和诸药，诸药合用共奏疏肝利胆、扶正祛邪之功。随着小柴胡汤的临床广泛应用和药监部门临床不良反应（ADR）报告系统的完善，国内外关于小柴胡汤毒副作用的报道也日益增多[5]，间质性肺炎是首报不良反应，即“日本小柴胡事件”，其后临床报道有肝损伤[6]，人肝细胞体外毒性实验发现小柴胡汤水煎液具有肝细胞毒性[7]。小柴胡汤因其有发散、疏肝、理气作用，容易伤肝阴，会导致肝阴虚、肝血虚、肝失疏泄、气不条达，降低肝脏的解毒和代谢功能[4]。小柴胡汤产生肝毒性可能为多成分综合作用在肝炎患者体内引起的一系列肝脏病变，但目前尚未见小柴胡汤治疗肝炎出现肝损伤的实验研究，无法合理判断小柴胡汤在治疗肝炎时药效和造成药物性肝损伤毒性（效-毒）的关系及其作用机制，不利于临床合理安全用药。本研究运用中药整合药理学平台[8]（TCM-IP）构建小柴胡汤作用的药物靶标和疾病靶标之间的相互作用网络，分析小柴胡汤治疗肝炎过程中产生药物性肝损伤的关键靶标和信号通路，尝试阐明该过程的“效-毒”作用机制，为实现经方小柴胡汤的精准化、安全应用和现代深入研究提供依据。

1方法

1.1化学成分和疾病靶标预测

借助TCM-IP平台中药材数据库对小柴胡汤所含中药材柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣进行化学成分信息检索，建立小柴胡汤的化学成分信息数据库及候选靶标信息数据库。在疾病/症状靶标数据库，以“肝炎（hepatitis）”作为疾病或症状关键词进行检索，提取小柴胡汤中治疗肝炎的药物名称、药物疗效、药物靶标的基因和蛋白质相关信息，作为候选靶标来源，建立“小柴胡汤-肝炎”靶标数据库。在疾病/症状靶标数据库，以“药物性肝损伤（DILI）”作为疾病或症状关键词进行检索，提取小柴胡汤引起药物性肝损伤的药物靶标的基因和蛋白质相关信息，作为候选靶标来源，建立“小柴胡汤-药物性肝损伤”靶标数据库。

1.2网络构建与靶标分析

通过TCM-IP平台的蛋白质-蛋白质相互作用信息（PPI）数据库，可直接获得小柴胡汤作用的潜在靶标与“hepatitis”“DILI”靶标之间的PPI，并构建相互作用网络，以节点连接度（degree）值≥2倍中位数为筛选条件，选取方剂靶标-疾病基因互作网络的核心节点（hubs）；以度值、节点紧密度（closeness）和节点介度（betweenness）的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为候选靶标；通过基因功能和通路进行富集分析，进一步挖掘分子机制，并构建“方剂药材-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次网络关联图。

1.3基因功能和通路分析

采用TCM-IP平台基因本体数据库（geneontology，GO）和全基因组及代谢途径数据库（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG），提取靶标基因或蛋白质的分子功能（molecularfunction）、细胞内定位（subcellularlocalization），及其所参与的生物学反应（biologicalprocess）和通路（pathway），结合富集计算得出的小柴胡汤直接作用靶标和肝炎及药物性肝损伤的核心靶标，进行基因功能分析和通路分析，并将所得结果按照P值降序排列，选取P值在前20的靶点、基因功能和通路进行分析。

1.4共有通路机制分析

将TCM-IP平台所整理出的小柴胡汤治疗肝炎及小柴胡汤造成药物性肝损伤的“成分-靶标-通路”网络中关键靶标所参与的通路信息及相关基因通过Cytoscape软件进行整理分析，得到其共同参与的通路及靶点，带入KEGGMapper，分析得多条通路的共有机制，挖掘本方剂的“效-毒”关联机制。

1.5小柴胡汤治疗肝炎的药效及造成药物性肝损伤的毒性作用机制文献验证

在中国知网及PubMed检索小柴胡汤治疗肝炎以及造成药物性肝损伤的相关文献，将提及“小柴胡汤”“肝炎”“肝损伤”的文献进行分析，查找临床应用及诊断指标、药理实验研究中所得小柴胡汤治疗肝炎药效及造成药物性肝损伤的毒性作用机制，并对小柴胡汤中君臣药对所含主要化学成分进行分析，对本研究分析所得的“效-毒”机制进行文献验证。

2结果

2.1化学成分靶标预测

根据TCM-IP数据库收集得到小柴胡汤中含有的个活性化合物基本信息，其中41个来自半夏，主要为生物碱、核苷和有机酸类化学成分；62个来自柴胡，主要为柴胡皂苷类、酸类、醇类等；72个来自大枣，主要为有机酸、三萜苷类、生物碱类等；个来自甘草，主要为黄酮、皂苷类化学成分；54个来自黄芩，主要为黄酮类和苷类；个来自人参，主要为人参皂苷类、多糖、挥发油等；个来自生姜，主要为挥发油、氨基酸类成分，各味药预测靶标数量见图1。

2.2小柴胡汤预测靶标生物信息学分析

如图2所示，对小柴胡汤候选靶标进行基因分析，取P值排名前20得到候选靶标具有的功能信息涉及的生物过程有氧化还原、谷胱甘肽衍生物合成、三羧酸循环等；细胞组成有线粒体、线粒体基质、胞外体、髓鞘等；分子功能有细胞外谷氨酸门控离子通道活动、线粒体电子传递等条目。

对候选靶标进行通路富集分析，取P值排名前20得到候选靶标参与的通路信息，涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、碳代谢、氧化磷酸化、能量代谢、糖酵解/糖异生、丙酸酯代谢、丙酮酸代谢、P酶异物代谢、核苷酸代谢等。研究还显示小柴胡汤在阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、神经退行性疾病等的治疗中存在一定应用价值。

2.3小柴胡汤治疗肝炎与造成药物性肝损伤的候选靶标网络构建

通过TCM-IP平台的PPI相互作用数据库，建立小柴胡汤药物靶标与疾病靶标之间的相互作用网络。根据条件筛选出与小柴胡汤治疗肝炎药效相关的核心靶标个，其中潜在靶标（putativedrugtarget）个；筛选出小柴胡汤造成药物性肝损伤的核心靶标个，其中潜在靶标个。图3、4为根据度值排序仅显示排名前位的靶点，图中节点的大小与度值呈正比关系。

由图5所示，对肝炎和肝损伤的各前个靶点进行分析，“肝炎-药物性肝损伤”的共有靶标为40个。分别对肝炎及肝损伤排名前20的靶点进行分析，“小柴胡汤-肝炎”特有靶标有ADH1C、ATP1A1、NT5C2、PRKAA1、HSD17B10、ALDH7A1、POLE4、EHHADH、ATF1、AKT1；“小柴胡汤-药物性肝损伤”特有靶标有B4GALT4、PRKCD、CDK9、B4GALT2、GNB1、DYRK1A、ECHS1、MAP2K1、PRKAA2、TP53；“肝炎-药物性肝损伤”共有靶标有HADHA、HADH、NSDHL、ADH1A、ALDH3A2、GCK、ENPP1、ADCY2、ADCY1、ADCY5，且排名均较靠前，由图中节点大小可看出，其中网络中连接度最高的节点为HADHA基因，在“小柴胡汤-肝炎”网络中能与个疾病靶标发生相互作用，在“小柴胡汤-药物性肝损伤”网络中能与个疾病靶标发生相互作用。有研究表明，肝细胞损伤后该基因会出现差异表达，参与脂质代谢、炎症、应激反应等功能[9]；HADHA的先天性基因突变还可能造成肝功能衰竭[10]，HADHA还对细胞脂变方面起保护作用，抑制HADHA的表达显著减少氧化应激的程度。靶标网络分析及研究表明，小柴胡汤的“效-毒”机制可能与HADHA的表达有密切关系。

2.4小柴胡汤治疗肝炎和造成药物性肝损伤的关键靶标功能和通路分析

对小柴胡汤药物靶标、肝炎疾病靶标、药物性肝损伤靶标进行基因功能分析和通路分析，取P值排名前20的通路，结果见图6、7。可以看出，“肝炎-药物性肝损伤”共有基因功能主要涉及ATP结合、血小板活化、蛋白质结合、蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、细胞外泌体、线粒体、髓鞘等条目。通路富集分析得“肝炎-药物性肝损伤”共有通路主要涉及趋化因子信号通路、内分泌和代谢疾病、内分泌系统、雌激素信号通路、神经系统、神经退行性疾病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。

有研究表明乙型肝炎患者的血小板活化及血小板参数均呈现异常表达情况，且不同严重程度者的表达也存在明显差异，表明“肝炎-药物性肝损伤”的作用机制与血小板活化有关[11]；NAFLD经常在患有内分泌疾病中的患者中被检出，提示内分泌机制可能参与NAFLD的发病机制，为内分泌系统代谢通路在肝炎治疗中的作用做出了解释；雌激素可能通过抑制CXC趋化因子10（CXCL10）的表达，继而抑制CXCL10诱导的肝星状细胞迁移，可延缓肝纤维化的病情进展[12]，小柴胡汤可能通过影响雌激素信号通路保护肝脏；有研究从microRNAs角度揭示轻度慢性乙型肝炎炎症活动的分子机制，其中涉及了趋化因子信号通路，并调控了JAK-STAT信号传导途径增强了α干扰素（IFN-α）作用，增强机体免疫，进一步引起肝脏炎症活动[13]。

2.5多维网络构建及分析

通过TCM-IP平台进一步构建小柴胡汤“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次网络关联图，见图8、9。由图可知，小柴胡汤治疗肝炎的主要化学成分为个，引起药物性肝损伤的主要化学成分为个，共同参与“效-毒”作用的化学成分共计个，其中柴胡27个、人参74个、半夏13个、生姜8个、甘草32个、大枣39个、黄芩33个，主要包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芩苷、齐墩果酸、原人参二醇等。此个共有化学成分分别作用于30条主要作用通路，其中“效-毒”共有通路主要有内分泌系统、神经系统、趋化因子信号通路、雌激素信号通路、神经营养因子信号通路等13条通路，体现了中药“多成分-多靶点-多通路”的作用机制，符合中药复方协同作用的特点。

2.6小柴胡汤治疗肝炎“效-毒”机制探讨

将整合药理学平台所整理出的小柴胡汤治疗肝炎及引起药物性肝损伤的“成分-靶标-通路”网络中关键靶标所参与的通路信息及相关基因通过Cytoscape软件进行整理分析，筛选得小柴胡汤治疗肝炎及造成药物性肝损伤涉及的7条主要通路通路及31个关键靶点，见图10；KEGGMapper分析后得共同参与“效-毒”机制的为MAPKsignalingpathway、PI3K-Aktsignalingpathway、NF-κBsignalingpathway途径，见图11。预测小柴胡汤治疗肝炎及引起肝损伤机制与干预Ras/Raf/MEK/ERK、NF-κB、CASP3的信号传导通路相关。

2.7小柴胡汤治疗肝炎的药效及造成药物性肝损伤的毒性作用机制文献验证

临床应用小柴胡汤案例[14-16]明确小柴胡汤对急性肝炎、慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎等多种病因病机的肝炎均有明确疗效。急性肝炎临床症见恶寒发热、食欲不振、胃脘胀满等脾胃不和症状[17]，刘渡舟[18]提出“疏肝清热法、清利湿热法、疏肝利湿解毒法、清利解表双解法”等法治疗急性肝炎；病毒性肝炎病因多为“湿热毒邪侵袭入体”，邪毒不断耗伤正气，肝脾肾多脏受损[19]，而小柴胡汤具有扶正祛邪功效，方中君药柴胡透邪解瘀，可引药入肝经，臣药黄芩味苦性寒，清泄邪热，与诸药配伍，共行疏肝解郁、扶正祛邪之功[20]。临床应用报道40例服用小柴胡汤，9例在用药过程中出现了转氨酶升高及黄疸，肝活检证实为急性肝损害，停药后肝功能恢复；其中4例再次给药后重现肝损害，此过程或与小柴胡汤中柴胡、黄芩的原浆毒相关[21]。对小柴胡汤单味药进行毒性实验，柴胡、人参、半夏均为阳性反应，甘草为假阳性反应。小柴胡汤可引起急性肝炎潜伏期约2个月，在治疗过程中启动氧化损伤机制，对肝细胞造成损伤，使肝组织检查出现肝小叶中央性坏死、纤维化及胆汁淤积等病理变化[6,22]。归纳文献中小柴胡汤治疗急性肝炎、病毒性肝炎等过程造成肝损伤的临床指标及机制，见图12。

3讨论

本研究借助整合药理学平台构建小柴胡汤“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图，通过数据分析，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芩苷、齐墩果酸、原人参二醇等个成分共同参与“肝炎-药物性肝损伤”作用，实验研究表明柴胡皂苷a、柴胡皂苷d能显著降低肝损伤大鼠血清中ALT和AST的水平，减轻大鼠肝组织的病理变化，明显改善肝功能，但不同浓度的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对于细胞毒性呈现剂量相关性，通过氧化损伤机制，降低细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，破坏细胞膜，使细胞发生损伤而发挥毒性[23-26]；黄芩苷具有保护肝损伤、治疗慢性肝炎、抗肝纤维化等作用，其作用机制与其抑制炎症介质的分泌以及清除自由基、抗氧化、调节免疫功能等密切相关，黄芩苷亦对人肝细胞有一定的毒性，但其毒性贡献并不足以反映黄芩或小柴胡汤整体的肝细胞毒性[27-29]；齐墩果酸具有降低血清丙氨酸转氨酶的作用，临床治疗急慢性肝炎和肝硬化有一定效果，可通过非竞争抑制作用抑制丙型肝炎病毒复制酶NS5B活性，有实验研究发现长期给予小鼠小剂量齐墩果酸会导致肝纤维化的发生，肝纤维化的程度与血药浓度呈正比，产生肝纤维化的原因与Nrf2有关[30-32]；人参二醇组皂苷可生成稀有皂苷Rg3和Rg5，其通过修复受损的线粒体细胞膜降低通透性增加血液中转氨酶的活性并抑制了氧化应激反应，增加了谷胱甘肽（GSH）的含量，从而对肝脏起到了保护作用，但原人参二醇高浓度时对肝细胞的毒性较大[33-34]。研究报道所得化学成分共同参与了“效-毒”作用，后期可对复方小柴胡汤进行单味药毒性及配伍后毒性变化研究，明确产生肝毒性的化学成分。

本研究通过预测其发挥治疗机制的关键靶点及通路得出小柴胡汤主要化学成分通过HADHA、HADH、NSDHL、ADH1A等靶标作用于内分泌系统、趋化因子信号通路、雌激素信号通路、非酒精性脂肪性肝病等通路发挥“效-毒”作用，并对其靶点及通路进行分析，明确“效-毒”作用是通过作用于MAPKsignalingpathway、PI3K-Aktsignalingpathway、NF-κBsignalingpathway途径，干预Ras/Raf/MEK/ERK、NF-κB、PI3K/AKT信号传导途径发挥作用。MAPK信号通路是细胞内重要的信号转导系统，肝细胞内MAPK可参与脂肪代谢调控[35-37]。在肝脂肪变早期MAPK活性受到抑制，过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）及二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）等因子活性发生改变导致肝细胞内脂肪合成增加、分解代谢减少，可促进脂肪肝的形成，后期MAPK被激活可能参与肝细胞凋亡等过程[38]。Ras/Raf/Mek/Erk信号通路持续激活，会抑制细胞凋亡、促进细胞存活及促进耐药基因的表达，可导致肝炎细胞异常增殖。核转录因子-κB（NF-κB）是一种核蛋白因子，可以参与多种蛋白基因调控[39]。NF-κB的活化与肝脏炎症、纤维化等过程密切相关，其活性增加可使环氧合酶2（COX-2）、白细胞介素-6（IL-6）及IL-8等基因表达相应的产物，加剧肝脏炎症，并通过炎性介质进一步激活NF-κB，造成肝脏纤维化的发生。实验研究，通过抑制其活性后可降低AT1RmRNA表达，减轻炎症及纤维化的程度[40]。PI3K/Akt通路可调控多种细胞生理信息传导，参与机体内各细胞周期运转[41-42]，启动细胞凋亡机制，并激活细胞侵袭特性。研究表明丝裂霉素（MMC）能够刺激肝干细胞发生凋亡，其诱导凋亡的作用便是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的[43-44]。

综上，通过对小柴胡汤治疗肝炎的“效-毒”关联的机制通路进行分析预测，获知小柴胡汤可能由MAPK、PI3K-Akt、NF-κB多条信号传导通路通过调控细胞增殖、细胞凋亡、调控炎症因子的表达等产生“效-毒”作用，为小柴胡汤的精准化、安全应用和现代研究提供依据，但对应靶点上的“效-毒”作用的调控机制及明确的“量-效-毒”关系、临床安全用量等还需进一步的药理实验验证，尤其是病证背景下的“量-效-毒”关系和作用网络靶点的验证，以确保小柴胡汤在临床合理辨证用药的安全性。

参考文献（略）来源：刘静，李晓宇，吴恺怿，黄娜娜，孙蓉.小柴胡汤治疗肝炎时出现肝损伤的“效-毒”作用网络分析与机制预测[J].中草药,,50(21):-.　　　　　　　　　　　　　　　　







































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