抑郁症是一种慢性高复发率的疾病，临床以显著而持久的情绪低落为主要特征，其病因复杂，症状多变，中医学理论根据其临床表现将其归于郁证、脏躁、梅核气、百合病、奔豚等疾病范畴[1]。针对现有化学药物治疗抑郁症的局限性，从天然药用植物中提取抗抑郁有效成分及开发中药复方制剂治疗抑郁症愈来愈引起人们的重视[2]。中医传统方剂丹栀逍遥散[3]、柴胡疏肝散[4]、四逆散[5]等在治疗抑郁症的研究中均取得了显著的疗效。柴胡-白芍药对记载于《太平惠民和剂局方》，是逍遥散、柴胡疏肝散、四逆散等多个中药古方的重要组成，具有疏肝解郁、调和气血的功效。

cAMP-CREB-BDNF通路作为抗抑郁药物的重要机制通路之一，近代研究者们发现cAMP-CREB-BDNF通路与大脑学习记忆功能有着重要的关系，余汇等[6]、魏浩洁等[7]研究均发现cAMP-CREB-BDNF通路是抗抑郁药物起作用的重要途径和作用靶点之一。本课题组也发现交泰丸可以通过调节cAMP-CREB-BDNF通路发挥抗抑郁作用[8]。课题组前期实验发现柴胡-白芍药对具有明显的抗抑郁作用，并可以通过调节抑郁模型大鼠脑内单胺类神经递质的含量而发挥抗抑郁的作用[9-12]。本研究在课题组前期研究的基础上，建立慢性温和不可预知应激（CUMS）大鼠抑郁模型，进一步探讨柴胡-白芍药对是否可通过调节cAMP-CREB-BDNF通路而达到抗抑郁的作用。

1材料

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠，体质量～g，由北京维通利华动物实验中心提供，动物合格证号SCXK（京）-，饲养于天津中医药大学实验动物中心。

1.2药品与试剂

柴胡、白芍饮片由安徽省亳州市药材总公司中西药公司提供，均由天津中医药大学中药学院李天祥教授鉴定，均为《中国药典》年版规定的正品；盐酸氟西汀胶囊（百优解，批号A，礼来苏州制药有限公司）；鼠源环磷酸腺苷（cAMP）ParameterAssayKit试剂盒、脑源性神经营养因子（BDNF）QuantikineELISAKit试剂盒、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（p-CREB）（S）DuoSetIC2Plate试剂盒（美国RD公司）；磷酸二酯酶抑制剂（PDE4）PDE-GloTMPhosphodiesteraseAssay（美国Promega公司）。

1.3仪器

Digibehave双画面动物行为视频分析系统2.1版、开场行为观察箱（上海吉量软件科技有限公司）；ST系列一次性使用真空采血管（肝素钠，5mL），北京积水创格医疗科技有限公司提供；电子超声匀浆器，美国UntrasoundTechnology公司；高速低温离心机，美国Beckman公司；超纯水系统，天津市奥佳科技有限公司。

2方法

2.1药物制备

柴胡、白芍、柴胡-白芍药对各提取物的制备均按照本课题组前期研究方法制备[9]，全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液或混悬液，需超声溶解。

2.2CUMS模型制备、分组与给药

模型建立前大鼠适应性喂养7d后，经开场实验行为学测试后，选择行为比较接近的大鼠只，随机分为12组，分别为对照组，模型组，阳性药对照组（盐酸氟西汀，15mg/kg）和柴胡-白芍药对低、中、高剂量（柴胡-白芍1∶1，生药剂量8、16、32g/kg）组，单用柴胡低、中、高剂量（生药8、16、32g/kg）组，单用白芍低、中、高剂量（生药8、16、32g/kg）组，除对照组大鼠外，其余各组大鼠均接受35d慢性温和不可预知应激（CUMS）刺激，包括4℃冷水游泳5min；昼夜颠倒；夹尾持续2min；振荡2min；禁食24h；禁水24h；具体刺激操作方法参考课题组前期实验研究[10]。在CUMS刺激21d后，各给药组大鼠分别按10mL/kgig相应药物，对照组和模型组则ig给予等量的生理盐水，连续14d，各给药组给药同时继续进行相应CUMS刺激。

2.3大鼠海马组织中cAMP、p-CREB、BDNF、PDE4含量以及大鼠血浆中cAMP含量的测定

在第36天，大鼠腹主动脉取血；冰上操作取出大鼠脑组织并迅速分离出海马组织、下丘脑组织和皮质组织，然后置于?80℃冰箱中保存待测。严格按照试剂盒说明操作，测定大鼠海马组织中cAMP、p-CREB、BDNF、PDE4水平以及大鼠血浆中cAMP水平。

2.4大鼠脑组织（海马组织、皮质、下丘脑）中BDNFmRNA表达量的测定

根据试剂盒说明，采用QiagenRNeasyminikit试剂盒分别提取CUMS模型大鼠海马、皮质和下丘脑组织30mg左右，加入μLBufferRLT（现用现配），充分粉碎组织，r/min离心3min，移出上清液，移至新的无酶炮弹管中，加入等体积的70%乙醇（由RNAfree水和无水乙醇配制），混合均匀，将所有液体转移至2mL分离柱中，r/min离心15s，取上清，加入μLBufferRW1，盖紧盖子，r/min离心15s，将液体用移液枪吸出，将柱子小心转移到新的分离柱中，加入μLBufferRPE，盖紧盖子，r/min离心15s，将液体用移液枪吸出。重复1次，空离1min，转移到新的1.5mL集合管中，加入30～50μLRNase-free水盖紧盖子r/min离心2min，检测RNA浓度，?80℃保存。逆转录合成cDNA：按照反转录试剂盒说明冰上操作，合成cDNA于?80℃保存备用。荧光定量PCR实验：应用ABI?7实时荧光定量PCR仪分析软件测定BDNFmRNA的表达。反应以GAPDH作为内参，引物序列见表1。

2.5统计方法

实验数据以表示，使用SPSS19.0软件进行数据统计分析，组间比较使用单因素方差分析（One-WayANOVA）。

3结果

3.1对CUMS大鼠海马组织和血浆中cAMP水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马组织和血浆中cAMP水平显著降低（P＜0.01）。盐酸氟西汀组，柴胡-白芍药对低、中、高剂量组和白芍高剂量组均能不同程度地上调海马组织中cAMP水平，与模型组比较差异显著（P＜0.05）；盐酸氟西汀组，柴胡-白芍药对中、高剂量组，单用柴胡高剂量组，单用白芍中、高剂量组均不同程度地上调血浆中cAMP水平（P＜0.05)。结果见表2。

3.2对CUMS大鼠海马组织中PDE4、p-CREB、BDNF水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马组织中PDE4水平显著升高（P＜0.01）。盐酸氟西汀组、柴胡-白芍药对中、高剂量组和柴胡高剂量组均能不同程度地下调海马中PDE4水平，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。与对照组比较，模型组大鼠海马组织中p-CREB水平显著降低（P＜0.05），盐酸氟西汀组、柴胡-白芍药对中、高剂量组，柴胡高剂量组和白芍高剂量组均能不同程度地上调海马中p-CREB水平（P＜0.05、0.01），其中柴胡-白芍药对中剂量组和柴胡、白芍高剂量组作用最为明显，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01）。与对照组比较，模型组大鼠海马组织中BDNF水平显著降低（P＜0.05），盐酸氟西汀组，柴胡-白芍药对中、高剂量组，柴胡高剂量组和白芍高剂量组均能不同程度地上调海马中BDNF水平，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01），结果见表3。

3.3对CUMS模型大鼠脑内海马、皮质、下丘脑组织中BDNFmRNA表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠脑内海马、皮质、下丘脑中BDNFmRNA表达显著下降（P＜0.05、0.01），柴胡-白芍药对中、高剂量组以及盐酸氟西汀组能一定程度上调BDNFmRNA表达，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01），结果见表4。

4讨论

柴胡-白芍药对是疏肝解郁的常用药对，二药合用既能疏肝解郁，治肝用之不达，又能柔肝益阴以补肝体，体现了中医理论肝“体阴用阳”的特性。

现代药理学研究发现柴胡主要有效成分为柴胡皂苷、挥发油、多元醇、植物甾醇等[13-14]，柴胡皂苷可以使抑郁大鼠脑内海马神经元数目明显增多，减轻神经细胞排列紊乱程度和神经细胞损伤程度，并且可以显著提高大鼠脑内BDNFmRNA的表达，而起到对大鼠脑内海马区的神经保护作用[15]；白芍主要有效成分为芍药内酯苷、芍药苷、白藜芦醇、苯甲酸等[16]。王景霞等[17]研究发现，芍药内酯苷能显著缩短小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间，说明芍药内酯苷具有抗抑郁作用。也有研究[18]表明白芍抗抑郁效应与氟西汀的作用相似，可以通过调节中枢单胺神经递质系统和增加BDNF的水平发挥抗抑郁作用。李春香等[19]研究发现柴胡白芍配伍使用，柴胡-白芍药对中芍药苷的溶出量明显增加。前期实验研究[12]中发现柴胡与白芍配伍使用对大鼠脑内单胺类神经递质水平的影响和抗抑郁的作用疗效更加明显。

抑郁可导致海马等多个脑区的神经元萎缩、死亡，进而引起神经系统功能损伤，cAMP-CREB-BDNF通路是调节抑郁症海马神经元再生的关键之一，cAMP作为一种重要的转录因子，在介导抗抑郁过程中参与大鼠学习记忆的活动，其含量增加能够逆转学习记忆能力的减退。PDE4是cAMP的特异水解酶，能够特异性催化cAMP水解，对细胞内cAMP的浓度调节起关键作用，进而调节cAMP-CREB-BDNF通路，并会影响一些参与学习记忆的蛋白质的合成，从而干扰长期记忆的形成[20]。抗抑郁药主要通过提高cAMP浓度，导致cAMP信号级联及其下游靶标p-CREB、BDNF等发生变化，从而发挥抗抑郁作用[21-22]。BDNF作为重要的神经营养保护因子，大量的研究发现[23-24]抑郁模型脑内BDNF表达含量明显降低，慢性应激可以降低BDNF在神经中枢的表达，经药物治疗后BDNF表达水平明显上升。而CREB是BDNF表达直接相关的核内转录因子[22]，参与神经元的兴奋、发育、凋亡以及突触可塑性等多个神经过程。本实验研究中发现柴胡-白芍药对治疗改善了CUMS模型大鼠海马和血浆中cAMP含量的降低及海马中PDE4含量的升高，同时明显上调了CUMS模型大鼠海马组织中BDNF含量和大鼠海马、皮质、下丘脑组织中BDNFmRNA的表达水平以及大鼠海马组织中p-CREB的含量，从而缓解CUMS大鼠的抑郁样行为改变，同时也发现单用柴胡或单用白芍效果较柴胡-白芍药对作用欠佳。

综上所述，可以表明柴胡-白芍药对可以通过调节cAMP-BDNF-CREB通路来发挥抗抑郁作用，单用柴胡、白芍不及柴胡-白芍药对。

参考文献（略）

来源：雒明池，梁如，高树明，高杉,李琳，于春泉.基于cAMP-CREB-BDNF通路探讨柴胡-白芍药对抗抑郁作用机制[J].中草药,,49(17):-.